朋友们，大家好！

欢迎继续咱们的“免疫生物学 学习之旅”~

Charles Janeway所著的Immunobiology: The Immune System in Health and Disease/免疫生物学：健康与疾病中的免疫系统，第一部分，1.An introduction to immunobiology and innate immunity/免疫生物学导论和先天免疫，分为下面三章：

第一章 免疫学基本概念，

第二章 先天免疫：第一道防线，

第三章 先天免疫的诱导性应答。

咱们就从第一章开始哈~

1. 免疫生物学导论和先天免疫

第一章 免疫学基本概念

第1-8期，咱们介绍了 Father of Immunology/免疫学之父 ，英国医生和科学家 Edward Jenner(1749-1823)/爱德华·詹纳 ， Father of Microbiology/微生物学之父的Robert Koch(1843-1910)/罗伯特·科赫和Louis Pasteur (1822-1895) /路易 ·巴斯德。

第9-10期，咱们介绍了两位科学家Emil von Behring(1854-1917)/埃米尔·冯·贝林和Kitasato Shibasaburō(1853-1931)/北里柴三郎的早期生涯和 发现 Serum Therapy/血清疗法(抗体) 的 相关 技术细节 。

今天，咱们就来聊下 白喉抗毒素 和 破伤风抗毒素 的后续发展。

发现白喉抗毒素和 破伤风抗毒素之后不久， Kitasato Shibasaburō/北里柴三郎 就回到了日本，为日本的现代医学发展做出杰出贡献，被誉为“日本现代医学之父”、“东方科 赫 ”，头像还被印在了1000日元新钞上。

但 抗毒素 临床应用的故事，就与他无缘了。

抗毒素的发现固然是科学的重大突破，但这项新发现要实实在在的造福人类，则还需要对抗毒素进行临床实验测试和工业化生产。

白喉抗毒素的临床实验

1890年秋 ，Behring/贝林与德国儿科医生Geßner合作，对一名5岁重症 Diphtheria/白喉 患儿注射豚鼠源白喉抗毒素。由于该血清效价(专业名词，大家可以理解为 抗毒素 中和毒素的能力)不足(豚鼠血清抗体浓度仅为马血清的1/50，但当时人们不知道)，而且患儿接受治疗时，已发病5天，毒素已经对身体造成了不可逆伤害，最终，在接受注射24小时后，患儿死亡， Behring/贝林 暂停了人体实验。

1891年夏 ， 法国巴黎 Louis Pasteur /路易·巴斯德 的高徒 Emile Roux(1853-1933)/埃米尔·鲁团队(白喉毒素是他们率先量产并分享给Behring/贝林的)，在3个患儿身上注射了羊源白喉抗毒素，结果出现了急性过敏性反应，最终造成2死1残。

1891年圣诞 ， Behring/贝林 使用改进版的羊源白喉抗毒素 ，治疗了一名已被实施气管切开术的6岁女孩(发病第二天)。当时， 她咽喉假膜覆盖>75%，发绀(因血液缺氧而导致 嘴唇、耳垂、鼻尖等处呈现青紫色)，呼吸频率达40 次/分。

而接受羊源白喉抗毒素治疗后：

首次注射后8小时：女孩假膜脱落减少，呼吸频率降至28次/分；

24小时：体温从39.8°C降至37.5°C，可饮水；

72小时：假膜完全消退，女孩康复了！

1893年起，德国柏林、汉堡等地儿童医院开展白喉抗毒素的对照试验，并发现治疗时机非常关键：发病2天内注射抗毒素，存活率达97%；延迟至第6天治疗，病死率与未治疗组相近(约30-50%)。此外，人们还发现，需要根据病情严重程度调整白喉抗毒素的用量。

诶，人们怎么知道血清里有多少看不见也摸不着的白喉抗毒素呢？这就要谈到抗毒素的标准化和工业化生产了。

白喉抗毒素的工业化生产

人们刚开始 在临床使用白喉抗毒素和破伤风抗毒素时，发现了两大问题：

那怎么办呢？

要解决第一个问题，得找个工业界的合作伙伴。事实上，当时德国领先的化工企业Hoechst(现Sanofi)，一直与柏林Institute for Infectious Diseases/传染病研究所保持密切联系。在了解到Behring/贝林的论文后，1890年底，Hoechst与Behring/贝林签订了协议，获得获白喉抗毒素和破伤风抗毒素专利授权：由Behring/贝林提供免疫方案；Hoechst提供动物设施和纯化设备。

但是，早期使用豚鼠作为“抗体工厂”，产量太低，而且抗毒素效价波动大(±70%)，而且因缺乏定量标准，临床疗效不稳定。而如果这些问题不解决，白喉抗毒素的工业化生产和大规模临床应用就要泡汤了。

关键时刻，Behring/贝林请来了一位高人Paul Ehrlich。1891年，同在柏林Institute for Infectious Diseases/传染病研究所工作的Paul Ehrlich (1854-1915)/保罗·埃尔利希，

发现了两种植物蛋白质Ricin/蓖麻毒素和Abrin/相思子毒素的抗毒素。而且，Ehrlich/埃尔利希发明了一种测定抗毒素效价的检测方法。

于是，1892年，在Behring/贝林邀请、老板Koch/科赫的支持下，Ehrlich/埃尔利希带领团队加入Hoechst，负责驻厂改进白喉抗毒素的生产工艺流程和测定抗毒素效价。

生产工艺流程方面，Ehrlich/埃尔利希最终选定了马作为“抗体工厂”来生产抗毒素，并且采用渐进增量免疫法，即由低到高缓慢增加注射的白喉毒素剂量，产量由此突破瓶颈，大幅提升。

抗毒素的标准化

那如何来测定看不见也摸不着的抗毒素的效价呢？办法非常巧妙，拢共分为3步：

建立冻干毒素标准品库；

确定Minimum Lethal Dose(MLD)/最小致死剂量；

测定 抗毒素 的效价

具体怎么做的呢？

一、建立冻干毒素标准品库

首先，从Corynebacterium diphtheriae/白喉棒状杆菌培养滤液中提取粗白喉毒素，然后加入(NH₄)₂SO₄/硫酸铵，根据(NH₄)₂SO₄/硫酸铵饱和度的不同，不同大小的蛋白会分级依次沉淀析出，从而初步纯化白喉毒素。

把得到的白喉毒素沉淀，装入Collodion/火棉胶或Cellophane/赛璐玢做的透析袋，浸入大体积低离子强度缓冲液(如生理盐水)中，间隔更换液体，持续24-48小时。由此，可以去除掉残留硫酸铵离子、小分子毒素、无机盐和糖类等小分子杂质，获得高纯度活性毒素溶液。

但是，液态毒素在室温下数日内即失活，无法长期保存，因此，Ehrlich/埃尔利希引入了冻干技术：

预冻处理：将毒素溶液分装至玻璃安瓿瓶中，置于−40°C以下低温环境(早期采用干冰-乙醇浴)快速冷冻，形成固态冰晶，避免冰晶生长破坏毒素蛋白结构

初级干燥(升华)： 在真空条件下(

二级干燥(解吸)：升温至20–25°C并维持低真空，移除残留结合水，最终残留水分≤1%。

密封保存： 在真空或充氮环境下把毒素熔封进安瓿瓶，避光冷藏(4°C)，建立“毒素标准品库”。

经过冻干处理的标准毒素 ，可 在4°C稳定保存数月，活性偏差Hoechst公司)，从而首次实现抗毒素效价的跨机构标准化。

二、确定MLD

有了标准毒素，就好像拿到了一把统一的尺子。用标准毒素，就可以定义Minimum Lethal Dose(MLD)/最小致死剂量，即能在特定时间内(通常24–48小时)杀死全部受试动物的最低标准毒素量。

具体来说， 将标准毒素原液用生理盐水稀释成梯度浓度(如1:10, 1:20, …, 1:100)，每组浓度注射至3–5只豚鼠，通过观察各组豚鼠48小时内的存活情况，确定Minimum Lethal Dose(MLD)/最小致死剂量。

三、测定抗毒素的效价

在测定好Minimum Lethal Dose(MLD)/最小致死剂量后，将待测定的固定量抗毒素(如0.5ml)，与递增量的毒素(如1, 2, 4 MLD)混合，37℃孵育30分钟。

然后 将该混合液注射至豚鼠皮下，记录各组48小时内死亡情况，找到中和终点：即抗毒素恰好中和毒素的剂量。比如，0.5ml抗毒素刚好中和4 MLD

/最小致死剂量毒素，而再多的毒素，就中和不了了，则该抗毒素的效价=4/0.5=8 AU/ml。

这里面，需要定义一下效价的单位：Antitoxin Unit(AU)/抗毒素单位，即为能完全中和1个MLD/最小致死剂量毒素的抗毒素量。

由此，Ehrlich/埃尔利希完成了白喉抗毒素的生产工艺流程优化和测定抗毒素效价。

1894年，白喉抗毒素首次量产， 德国 Diphtheria/白喉 死亡率从>50%降至15%，数百万儿童获救，Behring/贝林也被誉为Saviour of children/儿童救星。

破伤风抗毒素的临床应用

破伤风抗毒素的生产工艺与白喉抗毒素非常类似，但由于Diphtheria/白喉是当时继续解决的公共卫生危机，且破伤风抗毒素需要在受伤后立即注射，当时需求并不高(人们也不知道)，所以后者先被大量生产。一直等到1914年一战爆发，战壕环境导致Tetanus/破伤风高发(孢子经土壤污染伤口)。初期德军未普及破伤风抗毒素，野战医院伤兵发病率达9‰，死亡率近100%。

Behring/贝林力陈破伤风抗毒素的预防价值，推动德军于1915年4月起，强制要求所有伤员在清创后立即肌注破伤风抗毒素，使德军Tetanus/破伤风发病率降至Behring/贝林因此被誉“德军救星”，获颁普鲁士铁十字勋章。

贝林的后续发展

由于发现抗毒素的杰出贡献，Behring/贝林在1901年获得首个诺贝尔生理医学奖。

1904年，他在德国Marburg/马尔堡创立了Behringwerke公司，一开始专注于白喉抗毒素和破伤风抗毒素等传染病Serum Therapy/血清疗法研发(1892年 Behring/贝林跟Hoechst新签的授权协议不是独家的，所以他自己也能做)。后来公司辗转发展、合并，最终成为CSL Behring(是的，这个Behring就是Behring/贝林的那个Behring)，是目前全球最大血浆制品企业。

最后，大佬的人生总是充满了争议：Behring/贝林未将Ehrlich/埃尔利希 列入核心专利(DE78567)，导致后者未从与Hoechst的合作中获得经济利益，两人合作关系破裂，反目成仇。。。

今天就到这里啦~

Serum Therapy/血清疗法(抗体)被发现了，那背后底层生理机制是怎样的呢？Behring/贝林并没有给出答案。这就是下一期的故事了：Ehrlich/埃尔利希的“侧链学说”。

朋友们，下期见！~

Charles Janeway所著的Immunobiology: The Immune System in Health and Disease/免疫生物学：健康与疾病中的免疫系统，也是本次学习的大纲，分为5大部分：

An introduction to immunobiology and innate immunity/免疫生物学导论和先天免疫

The recognition of antigen/抗原的识别

The development of mature lymphocyte receptor repertoires/成熟淋巴细胞受体库的发育

The adaptive immune response/适应性免疫应答

The immune system in health and disease/健康与疾病中的免疫系统

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当然，限于颜色选择，有时候会有一些小的例外，比如 CIBA 和 Sandoz 。另外，这个系统也会继续进化完善~